Page 45 - หนังสือที่ระลึก สิรินเด้นท์ มหิดล for ebook

ส ำนักงำนกำรวิจัย คณะทันตแพทยศำสตร์ มหำวิทยำลัยมหิดล
6 ซอยโยธี แขวงพญาไท เขตราชเทวี กรุงเทพฯ 10400 โทร. 02-200-7621 โทรสาร 02-200-7698

หน้า …2/3…........
เลขที่รายงาน..018/2563.....

รำยงำนผลกำรทดสอบควำมเป็นพิษของยำสีฟันน ำมันมะพร้ำว
กับเซลล์ L929 (Mouse Fibroblasts) โดยวิธี MTT Cytotoxicity Test

กำรเตรียมเซลล์
5
น้าเซลล์ L929 ที่มีความเข้มข้นจ้านวน 1 x 10 เซลล์ต่อลูกบาศก์เซนติเมตร ในอาหารเลี้ยงเซลล์ MEM
completed medium เติมลงในจานเพาะเลี้ยงเซลล์ชนิด 96 หลุม จ้านวน 100 ไมโครลิตร/หลุม น้าไปบ่มเพาะเลี้ยง
ในตู้ CO2 Incubator ที่อุณหภูมิ 37 C, ความชื้นสัมพัทธ์ 95%, 5.0% CO2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จะได้เซลล์ลักษณะ
เป็นชั้นเดียว (monolayer)
กำรเตรียมตัวอย่ำง
ชั่งตัวอย่างยาสีฟันน้้ามันมะพร้าว 1 กรัม ละลายในน้้าปราศจากเชื้อ จ้านวน 5 มิลลิลิตร ละลายตัวอย่าง
ให้เป็นเนื้อเดียวกันและน้าตัวอย่างยาสีฟันไปปั่นที่ความเร็ว 8,000 รอบ/นาที เป็นเวลา 5 นาที โดยปั่นตัวอย่าง จ้านวน
2 ครั้ง จากนั้นจึงน้าตัวอย่างมากรองผ่าน Syringe Filter ที่มีขนาด Pore size 0.22 m จะได้ความเข้มข้นของ
ตัวอย่าง 20% จึงน้าตัวอย่างมาเจือจางให้ได้ความเข้มข้น 0.02, 0.2 และ 2% แล้วน้าตัวอย่างที่ได้ไปทดสอบ
กำรทดสอบ
น้าตัวอย่างยาสีฟันน้้ามันมะพร้าวที่เจือจางความเข้มข้น ให้สัมผัสกับเซลล์เป็นเวลา 2 นาที โดยแบ่งเป็น
กลุ่มควบคุมและกลุ่มตัวอย่างที่ต้องการทดสอบ ใส่ลงไปหลุมละ 100 ไมโครลิตร แบ่งเป็นกลุ่มควบคุมและกลุ่ม
reagent control ได้แก่ อาหารเลี้ยงเซลล์
®
- กลุ่มควบคุมลบ negative control material ได้แก่ วัสดุ Thermanox Plastic coverslips
2
Lot. No. 600562 โดย extraction ratio ที่ใช้ในการทดสอบคือ 6 cm /ml แช่ใน extraction
- กลุ่มควบคุมบวก positive control material ได้แก่ Polyurethane film containing 0.1%
ZDEC Polyurethane Film (RM-A) Lot No. A-201K โดย extraction ที่ใช้ในการทดสอบ
2
คือ 6 cm /ml
ดูด Extract ของชุดควบคุมและตัวอย่างที่ต้องการทดสอบออก ล้างด้วย PBS (1x) จ้านวน 1 ครั้ง แล้ว
เติมสาร MTT ความเข้มข้น 0.1% ซึ่งละลายอยู่ใน DMEM without supplements and without phenol red
ใส่สารละลาย MTT ลงในจานเพาะเลี้ยงเซลล์หลุมละ 50 ไมโครลิตร จากนั้นบ่มเพาะในตู้ CO2 Incubator ความชื้น
สัมพัทธ์ 95%, 5.0% CO2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง เมื่อครบเวลาดูด MTT ออก ล้างด้วย PBS (1x) จ้านวน 1 ครั้งแล้ว
เติม isopropanol หลุมละ 100 ไมโครลิตร เขย่าเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นน้าไปวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น
570 นาโนเมตร ด้วยเครื่อง Microplate reader

QF-DTRC-P09-01 REV-02 31/1/63

27